1.了解目的蛋白对整个WB实验的重要性

1）了解目的蛋白，才知道目的蛋白在实验样品中是否有表达

WB实验检测，很多小伙伴会遇到的问题之一就是无条带，也就是阴性结果，如何判断阴性结果是实验操作问题造成的“假阴性”还是本该如此的“真阴性”，这就需要大家在实验前，就对目的蛋白有一个清晰的认识。很多蛋白的表达是有组织特异性的，例如IL-10R，在视网膜，脾脏和肺腺癌组织中有高表达，其他组织表达含量较低；还有一些蛋白，则需要特定的刺激条件才会高表达，这种情况往往在磷酸化蛋白及炎症因子蛋白等中较为常见，如果未做特殊的处理，目的蛋白表达含量很低，无法被WB检测出。

2）了解目的蛋白，才知道如何制备样本

样本制备也是WB的关键步骤，后续的文章中也会为大家详细分析。如何选择合适的样本制备方法，关键因素就是要了解目的蛋白；除了上面一步中的要了解目的蛋白表达组织，及预处理条件外，还需确认目的蛋白表达的亚细胞定位，例如，细胞膜蛋白，核蛋白，线粒体蛋白和胞浆蛋白的提取方式都不一样，选择合适的方式，才能制备合格的样品，方便后续的WB实验。另外一个需要注意的因素就是需要加入对应的蛋白酶抑制剂，这一点对于磷酸化的蛋白尤为重要，否则蛋白在提取过程中就被降解，会造成“假阴性”结果。

3）了解目的蛋白，才知道如何选择内参

内参抗体，是WB实验中的重要参考，WB可以对目的蛋白进行半定量分析，判断不同样品中目的蛋白表达含量的多少，就是取决于内参的标定。内参选择在WB实验中是很关键的因素，可不是GAPDH或者β-actin万能的。内参如何选择，重要的决定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表达位置及预处理条件。

内参的选择及推荐，bioss讲堂：https://mp.weixin.qq.com/s/J385FDwOs7ZmBc5cbLlwDQ

2. 目标条带没有信号

3.图片背景过高，难以分辨条带

4.膜上出现黑点和黑斑

5.出现非特异性条带

6.条带中出现整条白色空斑

7.条带中出现白圈

8.条带拖尾

9.条带变形

10.条带呈哑铃状

11.最边缘条带弯曲

12.背景非均一性

13.条带呈“微笑”或“倒微笑”状

14.蛋白分子量偏高或者偏低

可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。

蛋白质降解，蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。

15.所有条带连成一片没有间隔

原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。

16.蛋白提好后的储存方式？

蛋白尽量放在-80℃，如果没有条件也可以放在-20℃，建议做好蛋白定量后分装成若干支，之后做检测时取一支加上样缓冲液处理，其余避免反复冻融。

17.如何避免蛋白被降解？

一些组织和细胞内经常含有蛋白酶，在提取蛋白质的过程中，有可能消化目的蛋白，总体上可以从以下几个方面来避免蛋白被降解：

1）提取蛋白质时，避开蛋白酶的最适活性温度。常见的哺乳动物组织或细胞的蛋白样品的制备都可在低温下完成，所有的试剂都需预冷，以降低蛋白酶活性，防止蛋白降解。尤其是消化系统相关的组织样品尽量取新鲜的样品制备，制备方法选用液氮研磨的方法，将样品降解可能性降到最低。

对于斑马鱼等冷血动物，在低温提取其细胞内蛋白质时，细胞内蛋白酶活性比较高，蛋白质容易被降解，然而在高温下（50-60℃左右），其蛋白酶活性低，蛋白质降解少。

2）加快提取速度。对于组织来说，取样顺序最先取消化系统相关的组织（如胃、大小肠、肝脏、胰腺等）和富含巨噬细胞的组织（如肺 )，然后取生殖相关的组织（如卵巢、子宫、睾丸等），最后取心、脾、肾、脑等器官。取下的组织冻存在液氮或 -80℃冰箱里。少数细胞系，如 Raw 264.7、U-937 等，也含较多蛋白酶，在提取时也需要快速提取，在不影响提取效果的前提下，可考虑用高浓度 SDS 等强烈的裂解液以缩短裂解时间

18.胶浓度如何选择？

凝胶对蛋白质的分离取决于凝胶所形成的孔径大小。不同分子量的蛋白质选择不同的凝胶浓度（指分离胶浓度，即每 100 亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度），凝胶浓度和线性分离范围的关系参照下表：

19.何种情况下使用梯度胶

SDS-PAGE 梯度胶适用于分子量在 30-150 kDa 的蛋白质检测。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，低浓度的丙烯酰胺溶液首先从底部灌入，而后溶液浓度呈梯度上升，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。梯度胶比单一浓度凝胶的分离范围宽，可以同时分离较大范围分子量蛋白质，降低多次制胶和转膜给实验带来的误差，

更有利于实验结果的准确分析。

20. 超大/超小分子量蛋白质分离技巧

对于大分子量蛋白质 (>150 kDa) 转膜，建议采用湿转转移过夜（有条件的客户可在 4℃下进行），一般采用恒压法：20 V 过夜。

对于小分子量蛋白质（分子量一般低于 10 kDa）一般使用三层胶，使用 Tris-Tricine 电泳液系统恒流 120 mA，

120min，而后选择 PSQ 膜并使用半干转移法。三层胶分别为浓缩胶，夹层胶和分离胶，其中夹层胶的作用是阻挡一

些大分子量的蛋白质，从而使小分子量的蛋白质或者肽段能够在分离胶内得到更好的呈现。

21.如何选择合适的封闭体系？

1）脱脂奶粉是最常用的封闭剂成分，通常使用 TBST+5% 的脱脂奶粉，但是脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素，此时可选择使用 BSA。

2）分析磷酸化蛋白须用 BSA。封闭与稀释抗体不建议使用脱脂奶粉，因为奶粉中的磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化，脱脂奶粉同时也不适用于碱性磷酸酶 (AP) 检测系统。

3）如果用辣根过氧化物酶 (HRP) 检测系统，封闭液及后续步骤不应加叠氮钠 (NaN3)，因为叠氮钠对辣根过氧化物酶 (HRP) 有抑制作用。

4）如果二抗抗体是碱性磷酸酶 (AP) 标记的检测系统，可使用酪蛋白封闭，同时须选择 TBS 缓冲溶液，不可使用PBS 缓冲溶液，因为 PBS 缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。

一般使用 TBST（或 TBS）+5%BSA（或脱脂奶粉）作为封闭液以及抗体稀释液。选择 PBST( 或 PBS）+5%BSA作为封闭液以及抗体稀释液能获得更灵敏的检测效果，但同时也可能会带来弱背景。封闭时，采用 37℃封闭 1 hr、室温封闭 1.5-2 hrs 或者 4℃封闭过夜皆可，再用相应的 buffer 将封闭液清洗干净，进行下一步抗体的孵育。

 1.如何选择固定剂？

细胞固定是为了在保持细胞形态和结构完整的前提下使抗原固定，同时方便抗体与细胞膜或者其他亚细胞结构组分充分接触。固定剂可快速穿过细胞质膜，并将细胞中的生物大分子固相化，从而使死细胞的结构接近原生活状态，方便后续抗体抗原的结合以及检测。

固定试剂主要有 2 类：

1. 变性试剂：通过将蛋白变性再固定在细胞结构上的有机溶剂，如 90% 甲醇、70% 乙醇等，变性试剂一般与细胞膜磷脂双分子层有相互作用，因此同时具有破膜作用。如果采用变性试剂固定细胞，而抗体用来标记胞内蛋白，则不需要另外破膜。

2. 交联试剂：通过自由氨基基团使蛋白分子交联起来固定蛋白，如 4% 多聚甲醛、10% 福尔马林溶液等，如果采用交联试剂固定细胞，而抗体用来标记胞内蛋白，则需要另外破膜。

2.如何选择通透剂？

1）甲醛通透：

通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的100%甲醇至90%甲醇的终浓度，以通透细胞。通过离心分离去除甲醛或PBS，并在冰冷的90%甲醇（在1XPBS中的v/v）中重悬。在冰上通透至少10分钟，继续进行细胞免疫染色或将细胞储存于-20°C的90%甲醇中。

如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向CD标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，这类抗体保持结合目的靶标。但注意，某些荧光团（包括PE和APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

2）Triton™X-100通透：

进行离心使细胞沉淀，并去除上清液。按每100万个细胞大约100µl4%甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物，并阻止个别细胞出现交联。在室温(20-25°C)下固定15分钟。用足够的1XPBS离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在每一百万个细胞约100μl细胞通透缓冲液中重悬细胞。在室温孵育10分钟。继续进行染色操作或将细胞储存于-4°C的PBS溶液中过夜。

3.流式对照的设置

1）空白对照：即不进行标记的细胞。细胞内物质会被激发而产生自发荧光，如肿瘤细胞、含颗粒较多的细胞或长期培养的细胞等有相对较强的自发荧光。空白对照主要用于确定待测样本的基础荧光阈值或检测染色方法是否正确。

2）阴性对照：是流式细胞术中非常重要的一个步骤，而阴性对照中最重要的是同型对照的设置。同型对照是与实验染色抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，用于排除由于抗体非特异性结合到细胞上而产生的背景荧光信号的干扰，以划定阴阳性细胞群的分界线。同型对照需要选择与实验染色抗体相同种属、相同IgG亚型、相同轻链、相同荧光素偶联，另外使用时需要保证与实验染色抗体相同工作浓度而非相同稀释倍数。对于直标抗体染色标本，建议选择试剂公司提供的与抗体配套的同型抗体作为阴性对照；对于间接免疫染色样本，设置以同型抗体作为一抗再加荧光二抗的平行管作为阴性对照。（注：单核细胞、B细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、肿瘤细胞等细胞高表达FcR，同型抗体与细胞高度结合，会造成基础阈值较高而影响实验的准确性，需要封闭FcR，避免出现假阴性的结果。）

3）阳性对照：设置阳性对照是为了在使用某种荧光素偶联抗体前检测该抗体是否有效。一般在使用新的荧光素偶联抗体，且该抗体之前未使用过，或者虽然使用过但是批号不同时，需要设置阳性对照，对于储存时间较长的荧光素偶联抗体也可设置阳性对照。此外对于多色流式实验，可设置缺一对照（FMO），即标记除某一通道荧光抗体外的其他所有通道荧光抗体。通过FMO管可以更准确设门，更清楚地区分出阳性和阴性细胞群。

4. 使用流式细胞分析仪检测到的荧光信号较弱，或没有荧光信号。

5. 细胞的散射特性未达最佳标准（如前向和侧向散射值较低）

6. 在对样品检测细胞周期分布时，DNA含量的柱状图没有分解细胞周期的不同阶段，即G0/G1、S和G2/M期

7. 阴性细胞群中的信号较强

8. 使用流式细胞术备选实验步骤时，红细胞裂解不完全

9. 高背景

10.如何确定抗体的最佳使用浓度？

抗体滴定方法：用同种细胞，相同细胞数量与反应体积，加入不同量的抗体计算阳性峰荧光强度及信噪比（S/N>3）。

1、滴定的浓度范围尽量大，至少5个左右。

2、滴定实验条件要和实际实验条件一致，如反应温度、pH等。

3、弱表达或不分群的抗原不适合做滴定。

11.流式实验如何排除死细胞干扰？

死细胞的自发荧光水平很高；死细胞容易摄取抗体导致非特异性结合，最终影响实验结果；

死细胞还可能会释放DNA，DNA非常粘稠，会导致细胞成团，容易堵塞管路。

区分死细胞的方法

死细胞特性：细胞膜渗透性增强，失去膜完整性

1、DNA结合染料： PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只会进入细胞膜受损的细胞，结合到细胞的DNA上。

2、蛋白结合染料：结合细胞表面或膜内的游离胺，活细胞弱阳，死细胞强阳。 可以用在固定标本中的，区分样本固定细胞状态。

12.多色流式抗体的选择方法

1、只能使用由激光的相应波长的光激发荧光染料，为保证最佳检测效果，需了解使用仪器的激光/滤光片组合。荧光染料所发射光线的检测由滤光片控制（FL）。

2、了解使用的细胞群、抗原

低/未知表达或细胞稀少建议使用较亮的荧光染料，如PE。

高抗原表达或细胞群数量密集建议使用较暗的荧光染料，如FITC。

常用荧光及其强弱排序程度: PE>APC>PE-Cy5>PE-Cy5.5/PerCP-Cy5.5>FITC。

3、最大限度降低光谱重叠

4、确定marker的表达关系

相互排斥的抗原允许spillover；

共表达抗原避免spillover；

允许子代对亲代的spillover；

弱表达抗原最好放在untouched channel；

强表达抗原最好放在silent channel。

利用光谱工具查看荧光遗漏情况，降低荧光染料亮度避免重叠。

1.ELISA检测中的OD值缩代表的含义？

“OD值”这个概念想必做实验的各位小伙伴们都不陌生，从判断提取核酸的质量及浓度，到BCA蛋白定量进行蛋白定量，又或者是ELISA实验检测目的蛋白含量，这些常用的基础实验都需要检测样品的“OD值”，但是，“OD值”到底是个什么东西，我们在测量“OD值”的时候又有哪些需要注意的问题。

什么是“OD”值？

OD全称optical density，也就是光密度，也可以称为吸光度。吸光度指的是利用物质特有的吸收光谱，来鉴别物质或者测定物质的含量，也就是将一束特定波长的光通过被检测物，被检测物可以将光吸收掉一部分，通过吸光度计算被检测物的浓度。一般被检测物浓度越高，吸光度的值就会越高。实验中也是利用“OD值”和被检测物的浓度之间的关系来根据吸光度。

了解了“OD值”是什么之后，接下来我们再看看在不同的实验中测量“OD值”有哪些需要注意的。

需要注意的就是测量时的光波长。上文在介绍“OD值”概念时提到，吸光度利用的是物质特有的吸收光谱，实际操作中我们需要注意的关键的也是这一点，不同物质的吸收光谱不同，大吸收峰的波长也不同，为了达到好的测量效果，一般来讲，我们需要在待测物质的大吸收波长处来检测其“OD值”。例如，核酸在260nm波长处光吸收大，而蛋白和酚类物质则在280nm波长处光吸收大；BCA法检测蛋白含量时，显色反应后，溶液由浅绿色变为紫色，此时在560nm处有大光吸收值；TMB法显色的ELISA实验，在加入终止液后溶液由蓝色变为黄色，在450nm处有大光吸收。

除了吸收波长，一些实验还需要设置校正波长，校正波长往往远离大吸收波长，作为本底吸收，排除由于气泡、灰尘等其他系统误差造成的“OD值”偏差。根据测得的“OD值”，进行双波长校正，可以有效的减少系统误差造成的影响。

对于测量得到的待测样本“OD值”还需要进行换算才可以得到终的浓度，有很多小伙伴往往在这一步出现错误，功亏一篑。需要注意的地方也比较简单，就是根据对应试剂盒的说明书，采用推荐的曲线拟合方式进行拟合，拟合后需要看一下拟合曲线的R2值，约接近1证明曲线拟合度越高，结果越可信。如果R2值较低，则需要检查是否出现标准品稀释问题或实验操作出现失误。拿爱必信的试剂盒来举例，BCA 蛋白定量试剂盒而ELISA试剂盒系列产品，则推荐用四参数拟合方式进行标曲拟合。选择错误的拟合方式，会影响曲线拟合度，R2值较低，回归计算的待测样品浓度也不准确。温馨提示：BCA蛋白定量实验以及ELISA实验的显色过程都是受反应时间及温度等条件影响的，需要根据实验情况及时终止实验进行读数，做实验时尽量不要走开。

2.ELISA实验——OD值显示不正常，如何调整？

在ELISA实验中，最担心遇到的结果，莫过于样本中检测不到想要的指标，或者是指标的吸光度落在检测限之外，这时候应该怎么做呢？   

一、超出检测上限  这种情况比较常见于高表达的蛋白，稀释了一百倍还是在标准曲线之外，这时候您需要参考相关的文献，按照文献的稀释倍数去调整，但是因为样本的不同，文献的稀释倍数也并不一定适合您的样本，如果还是超出上限，继续进行稀释就可以。   二、低于检测下限——信号太弱  往往是由于目标蛋白的浓度太低了，可能是稀释倍数太高，也可能是本身目标蛋白含量就比较少。这种情况主要常见于在健康样本中对炎症因子的检测，表达含量往往极低。   

解决方案：  ①首先降低稀释倍数，一直降低到能够检测到有效的吸光度  ②增加抗体的孵育时间。如果说明书写着抗体需要在室温孵育2小时，而得到的结果不好，尝试在室温两小时孵育的基础上再增加4°C孵育过夜，使得抗体结合，或增加抗体的量，说明书上只是推荐的量，有些样本可能需要更多的抗体，进而提高检测信号。  ③将HRP浓度增加50%，或加倍，使得它在与TMB显色底物反应时产生更强的颜色。  ④ELISA盒子如果不是拿到手立即做实验，保存的时候应该避光保存，使TMB底物性能。TMB孵育的时候需要把ELISA板放在黑暗中，因为TMB对光非常敏感。  ⑤如果稀释倍数已经降低到样本原液，且做了实验的优化，依旧不能检测到，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，在表中可记录为0或标注低于检测下限。

如果依旧想要检测到或者需要做一个比较，可以选择灵敏度更高的试剂盒，更低的检测下限，就有更大的可能性能够检测到目的蛋白。

如果阳性对照孔都无法测到正常表达浓度，问题可能就是样品本身，是否不适用于ELISA实验，ELISA样品一般选择培养上清、血清、血浆，其他样品形式可能并不适合，此时就要考虑更换样品或者更换检测手段。

3.标准曲线较差

4.无信号

5. 变异系数（CV）较大

6.景偏高

7. 灵敏度偏低

8.BSA在免疫学中的应用

牛血清白蛋白，英文名称Bovine Serum Albumin（BSA），也称Cohn Fraction V，即第五组分（第五组分并不是BSA的一种组份，而是Edwin J.Cohn教授早期从血液中通过特定的分离技术得到5种组份，其中第五种就是白蛋白）。

BSA作为牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43 kDa，等电点为4.7。BSA有着极其广泛的实验室应用，除在细胞培养中作为营养物添加外，BSA主要还有以下用途：

1）在酶切反应体系中作稳定剂，对酶起保护作用，并防止其分解和非特异性吸附；

2）维持渗透压、提供pH缓冲、起载体作用；

3）作为蛋白定量检测的标准品使用，如WB中的蛋白定量等；

4）常规免疫实验中作封闭试剂使用，包括ELISA、WB和IHC等。

需要注意的是，WB常规使用含蛋白比较全面的脱脂奶粉来封闭，一般检测磷酸化蛋白时更推荐用BSA（脱脂奶粉含有磷酸化蛋白可能会有干扰）；常规方法封闭效果不佳时也可考虑使用BSA封闭以进行优化。

1. IHC抗原修复方法

原修复是针对石蜡包埋的切片的必要步骤，大多数甲醛固定的组织在开始染色前都要先修复抗原，这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。常用的两种方法为热修复法（HIER）和酶解法。

一、热修复法

1. 热修复缓冲液

适用于HIER的缓冲液有多种，我们推荐两种常用的缓冲液：pH 6.0，10mM柠檬酸盐缓冲液和pH 8.0，0.5mM EDTA缓冲液。具体使用哪种缓冲液可以参考您的抗体说明书，通常来讲，EDTA缓冲液适合多数磷酸化酪氨酸特异性抗体，而柠檬酸盐缓冲液则适用于其他多数抗体。

(1)、高压蒸汽法

将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内，然后将锅置于加热板并开至功率，此时不要把盖子盖紧。在等待煮沸过程中，进行脱蜡复水。煮沸后，将玻片放入高压锅，盖紧盖子，小心烫伤。高压锅达到压力后，维持3分钟。3分钟后，关掉加热板，将高压锅取下放置。释放蒸汽，冷水冷却锅身。压力下降后打开锅盖，冷水冷却10分钟。小心烫伤，修复完毕。

注意事项：

 3分钟只是建议时间，并不是所有抗原的修复时间，可以设置对照试验，分别设定1、2、3、4……分钟进行探索，确定修复时间。

确保玻片完全冷却再进行下一步实验。

2)、微波法

微波法不要使用家用微波炉，没有高压环境，修复时间长，会使切片解离。请使用科研微波炉。向微波炉容器中加入合适的修复缓冲液将玻片放入容器，置于微波炉内。将温度设置在98℃维持20分钟以修复抗原20分钟后，取出容器放置于水中冷却10分钟，小心烫伤，修复完毕。

注意事项：

要确保修复缓冲液足以浸没玻片几厘米，防止煮沸过程中变干。20分钟同样也是建议修复时间，可设置对照试验，自行探究修复时间。确保玻片彻底冷却。

二、酶解修复法

可依据抗体说明书选择需要的酶，如果没有，胰蛋白酶适用于大多数福尔马林/PFA固定后需要修复的抗原。常使用的酶解修复方法有滴管法和浸泡法。

(1)、滴管法

将胰蛋白酶预热至37℃。小心的将组织切片周围的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般50-100ul）。用吸管将酶溶液铺盖住整个切片，注意不要弄坏组织将玻片置于加湿器，然后37℃孵育。避免直接将玻片放入恒温箱架子上，否则会因温度不均影响染色质量。 盛放玻片的容器先预热再放入恒温箱内。10-20分钟后，取出玻片，流水冲洗3分钟。修复完毕。

(2)、浸泡法

将水浴温度设置为酶适宜温度。向盛放玻片架的两个容器中加入超纯水。容器放入水浴加热。

将玻片放入水浴箱其中一个容器加热用水浴箱中另一个容器中的热水制备抗原修复缓冲液，然后将盛有缓冲液的容器放回水浴箱中重新加热。将加热过的玻片放入酶溶液中10-20分钟并间歇缓慢震荡。取出玻片在流水下冲洗3分钟，将酶漂洗干净。 

注意事项：

有些酶需要特殊缓冲溶液和活性辅助因子。水或缓冲液体积要足够没过玻片若将冷玻片直接放入酶溶液中会使溶液温度降低从而酶活性降低，导致抗原位点修复不彻底。尽可能快的准备出抗原修复缓冲液以避免妨碍酶活性的发挥。放入玻片之前使溶液达到需要的温度。10-20分钟只是建议孵育实验。可自行设置对照实验探究孵育时间。

2.切片常见问题及解决方法

1）细胞皱缩和收缩；核“起泡”变大损伤；胶原染色嗜碱性

原因：石蜡温度过高。

解决方法：烤箱温度高于石蜡熔点5-10℃为佳。

2）切片卷成致密团

原因：①刀钝；②倾斜角太小；③切片太厚。

解决方法：①换新刀片；②如果间隙角充分，降低倾刀的斜度。

3）切片破碎或切不成片

原因：①组织固定、脱水、透明不彻底，浸蜡不透；②浸蜡包埋温度过高或时间过久。

解决方法：①优化组织处理；②及时更换试剂；③重新脱水补救；或者重取。

4）切片不成连片

原因：①刀刃不锋利，刀间隙角度大；②蜡块内组织上下端留蜡边太少或不整齐，刀边碎片；③室温过低或石蜡过硬。

解决方法：①移动刀口或更换刀片，检查刀的角度，清洁刀片和刀架背面；②在低熔点的石蜡中重新包埋；③提高室内温度或温暖蜡块表面（哈气等）；④切片厚度适宜（根据组织类型）。

5）切片易粘附与组织块

原因：①间隙角不足；②室温过高或包埋石蜡熔点低；③刀片、组织块边缘的碎片；④组织带静电。

解决方法：①增加间隙角；②清洁刀边；③修剪组织块的边缘；④湿润切片机周围的空气，地上洒水，开启加湿器；⑤放置静电防护器或切片机附近放置干燥板。

6）切片条带弯曲不直

原因：①蜡块上下两面不平行；②蜡块下边与刀口不平行；③切片处刀锋不一致；④组织本身硬度不一致。

解决方法：①重新修整蜡块，使上下两边平行；②将蜡块移正，与刀口保持平行；③移动刀片或更换刀片；④修去组织较软侧的蜡块。

7）蜡块组织脱落

原因：①在粗修蜡块时，先放组织后放蜡，否则组织与包埋蜡块黏贴不牢；②蜡块冻时间过长，切片时易出现蜡块脱落现象。

解决方法：①包埋先放石蜡后放组织，速度尽可能快；②切片动作小、匀速。

8）组织切片不完整，缺损

原因：①取材时未取中病灶，组织块太大，太厚；②多块组织包埋是排列不佳；③组织块内组织不平坦；④组织包埋方向失误；⑤切片时粗修过多（切削过深）或过少（没切到足够的深度）。

解决方法：①组织太大，脱水 不好，取材厚度3mm为佳；②组织在包埋模中均匀铺平；③熟悉各种组织的切片特点，避免包埋方向的失误（囊壁、管腔竖直包埋）；④切片方向：软到硬，易到难，主到次。

9）切片过厚

原因：①切片机维护不当，切片厚度设置错误；②石蜡太软（熔点低）；③石蜡过热；④刀钝。

解决方法：；①降低切片厚度设置；②定期校准和保养；③使用适合组织类型和密度熔点的石蜡；④常规病理组织切片厚度在3-4μm，淋巴结、脾脏、胸腺、鼻咽组织等含巴细胞成分较多的组织，薄切2-3μm，脂肪5-6μm。

10）切片纵裂，损伤，刀痕

原因：①组织中钙化点、钉、缝合线或纸屑等异物；②刀片缺口；3刀口不洁，含有毛屑、碎组织、皮棉或石蜡等；④石蜡中有杂质。

解决方法：①更换刀片或移动刀口；②使用面脱钙方法（20%HCl）；③仔细清洁刀刃以除去多余的石蜡堆积；④如果石蜡中有异物，用干净的石蜡重新包埋。

11）切片厚薄不均匀/跳刀/百叶窗/搓衣板

原因：①组织脱水过度；②切片刀不锋利，刀间隙角（或倾斜度）太大；③切片速度太快

④切片机部件松动或磨损；⑤组织致密或坚实；⑥主轴伸出太长。

解决方法：①处理过程中减少脱水时间；②更换刀片，减少倾斜度；③哈气；④均速慢切；⑤确保刀和组织的有关螺丝拧紧夹牢；⑥主轴摇回复原。

12）褶皱/折叠

原因：①摊片温度不合适，组织未充分伸展；②刀片不锋利，刀角度大；③石蜡熔点低，过软或室温较高；④组织缺乏一致性。

解决方法：①调小刀角度，边切边向蜡块吹气用10-20%酒精摊片，利用浓度差，水的张力来展片；②检查摊片水温，太冷不易展开；太热会产生褶皱或折叠，组织细胞散开；③更换刀片或移动刀口；④切片厚度是否合适。

13）切片裂缝/碎裂

原因：①组织固定和处理不完全，摊片是发生裂解；②摊片水温过高，摊片时间长导致过度延伸；③摊片时镊子撑开过大；④烤片前切片排水不净。

解决方法：①确保固定和处理完全；②在摊片时轻轻延伸蜡带，去除褶皱和折叠；③降低摊片水温（通常低于包埋蜡熔点的5-10℃）；④在切片和漂片过程中，小心操作蜡带；⑤在烘烤切片前应很好的排水。

14）栅状裂和龟裂

原因：①固定、透明、浸蜡不充分；②摊片水温过高；③过度脱水，去除了蛋白质结合的水，组织发脆，当漂浮在水面上是可能会裂开；④切片过程中过度冷冻。

解决方法：①优化组织脱水过程；②降低摊片水温；③切片过程中勿使用冷却喷雾剂，细胞易缩小；④匀速慢切，边切边对蜡块吹气。

15）切片中有气泡

原因：捞片时切片下面有气泡。

解决方法：①保持温水干净，无杂质；②切片要干净无污染；③捞片前将组织下的气泡赶走。

3. 染色结果呈阴性

4.染色深

5. 弱阳性染色

6. 弱阳性染色

1.病理标本收集及保存：

1）冰冻切片：取下适当的组织块放于液氮保存；

2）石蜡切片：取下适当的组织块放于4%多聚甲醛保存；

3）细胞爬片：细胞爬片4%多聚甲醛固定30min，换PBS浸没4℃保存。

2.分子生物学标本收集及保存：

1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存；

2）石蜡标本：常温保存；

3）全血标本：取适量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管；

4）体液标本：高速离心取沉淀；

5）细胞标本：细胞加TRizol裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。

3.蛋白质实验标本收集及保存：

1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存；

2）全血标本：取适量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管；

3）细胞标本：细胞加细胞裂解液充分裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。

4.ELISA、放免、生化实验标本收集及保存：

1）血清（血浆）样本：取全血加入促凝管（抗凝管），2500转离心20分钟左右，收集上清，液氮或者-80℃冰箱保存；

2）尿液样本：样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液参照此实行；

3）细胞样本：检测分泌性的成份时，样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；检测细胞内的成份时;

用PBS稀释细胞悬液，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，2500转离心20分钟左右，收集上清同上；

4）组织样本：切割标本后，称取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备用。

5.代谢组学标本收集：

1）尿液样本：样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液等参照此实行；

2）组织样本切割标本后，称取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备用；

 1. 冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2.细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO ？

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3.可否使用与原先培养条件不同之培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，严重则会造成细胞无法存活。

4.可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6.培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。